Структурные и механистические представления о грибковом β

Nature, том 616, страницы 190–198 (2023 г.) Процитировать эту статью

10 тысяч доступов

2 цитаты

57 Альтметрика

Подробности о метриках

Интегрированная в мембрану синтаза FKS участвует в биосинтезе β-1,3-глюкана, основного компонента клеточной стенки грибов1,2. ФКС является мишенью широко назначаемых противогрибковых препаратов, включая эхинокандин и ибрексафунгерп3,4. К сожалению, механизм действия FKS остается загадочным, и это препятствует разработке более эффективных лекарств, воздействующих на этот фермент. Здесь мы представляем структуры криоэлектронной микроскопии Saccharomyces cerevisiae FKS1 и устойчивого к эхинокандину мутанта FKS1 (S643P). Эти структуры обнаруживают активный центр фермента на границе раздела мембрана-цитоплазма и путь транслокации глюканов, охватывающий бислой мембраны. В структурах FKS1 наблюдаются множественные связанные липиды и заметные мембранные искажения, что указывает на активные взаимодействия FKS1 с мембраной. Мутации, устойчивые к эхинокандину, сгруппированы в области около TM5–6 и TM8 FKS1. Структура FKS1(S643P) обнаруживает измененное расположение липидов в этой области, что указывает на лекарственно-устойчивый механизм мутантного фермента. Структуры, каталитический механизм и молекулярное понимание устойчивых к лекарственным препаратам мутаций FKS1, выявленных в этом исследовании, продвигают механистическое понимание биосинтеза β-1,3-глюкана грибов и создают основу для разработки новых противогрибковых препаратов путем воздействия на FKS.

Инвазивные грибковые инфекции ежегодно уносят жизни более 1,5 миллионов человек, представляя серьезную угрозу здоровью населения5. Такие инфекции вызывают серьезную обеспокоенность (например, вызывают высокую смертность) для групп населения с ослабленным иммунитетом, а также пациентов с COVID-19 (ссылки 5,6) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html). ). Ограниченные классы противогрибковых препаратов и появление штаммов, устойчивых к лекарствам, таких как недавняя вспышка Candida auris с множественной лекарственной устойчивостью, создали серьезные проблемы в лечении инфицированных пациентов7,8. Поэтому существует острая необходимость в разработке новых противогрибковых средств8.

β-1,3-глюкан является фундаментальным компонентом клеточной стенки грибов2, поэтому нацеливание на его биосинтез является важной стратегией для разработки противогрибковых препаратов широкого спектра действия3,9. β-1,3-Глюкан клеточной стенки грибов синтезируется встроенной в мембрану синтазой FKS10,11, которая регулируется ГТФазой Rho1 (ссылки 12,13). ФКС переносит глюкозу от донорской УДФ-глюкозы к растущей цепи глюкана через β-1,3-гликозидные связи и транслоцирует полимеризованный β-1,3-глюкан во внеклеточное пространство (рис. 1,а). Ортологи FKS были идентифицированы у всех проанализированных грибов и необходимы для жизнеспособности многих известных грибковых патогенов. У Candida glabrata и S. cerevisiae одновременное разрушение FKS1 и FKS2 показало летальный фенотип14,15; FKS1 Candida albicans и Cryptococcus neoformans необходим для жизнеспособности16,17; плесень Aspergillus fumigatus с делецией FKS1 страдает серьезными дефектами роста и лизисом клеток18. В настоящее время на рынке имеются два хорошо известных противогрибковых препарата, нацеленных на ФКС: эхинокандин, противогрибковый препарат первой линии, широко используемый в клинической практике19, и ибрексафунгерп, недавно одобренный пероральный фунгицидный препарат4. Более новые агенты, воздействующие на функцию FKS (например, резафунгин), вступают в позднюю стадию клинических испытаний4. К сожалению, мутации FKS тесно связаны с резистентностью к эхинокандину и неэффективностью лечения, что является новой проблемой при инвазивных грибковых инфекциях20,21. Многочисленные клинически выявленные мутации, устойчивые к эхинокандину, сосредоточены в трех консервативных областях FKS20,22. Мутации в одном аллеле FKS достаточно, чтобы сделать штаммы грибов устойчивыми к эхинокандину23.

а — Модель клеточной стенки гриба. FKS1 использует UDP-Glc для синтеза β-1,3-глюкана. Графика на панели А была создана с помощью BioRender (https://biorender.com). b. Анализ FKS1 in vivo путем изучения роста штамма WT и штамма FKS1-KO (KO) с ингибитором FKS2 FK506 или без него. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка; n = 3 независимых эксперимента. в — активность in vitro очищенного CHAPS FKS1 с различными эффекторами: UDP-Glc, Rho1, GTPγS и противогрибковыми препаратами (каспофунгин (CFN) и микафунгин (MCF)). Активность измерялась путем мониторинга созданного UDP. Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка; n = 3 независимых эксперимента. г, д, Ферментативное расщепление водонерастворимого полимера, синтезированного с помощью GDN-очищенного FKS1 (S643P). Использовали специфическую эндо-1,3-β-глюканазу и эндо-1,4-β-глюканазу. Эти эксперименты были повторены трижды с одинаковыми результатами. Показано репрезентативное изображение образцов расщепления полимера (d) и гидролиза (d), отобранных в указанное время и подвергнутых анализу тонкослойной хроматографии (e). В качестве стандартов использовали глюкозу (G1), ламинарибиозу (G2), ламинаритриозу (G3) и ламинаригексаозу (G6) (дорожка М). f — анализ гликозильных связей (метилирования) полимера, синтезированного с помощью GDN-очищенного FKS1(S643P). Представлен профиль газовой хроматограммы частично метилированных ацетатов альдитолов, полученных из синтезированных полимеров. Доминирующий пик (обведен зеленым пунктирным прямоугольником) представляет собой связь 1,3-Glcp, подтвержденную масс-спектрометрией (расширенные данные, рис. 2d). ж, Схема доменной организации FKS1. h: Крио-ЭМ-карта FKS1, вид параллельно мембране. Карта сегментирована на четыре части, окрашенные буквой g, с липидоподобной плотностью светло-желтого цвета. i. Два ортогональных вида структуры FKS1 в мультипликационном отображении. Четыре части FKS1 раскрашены, как показано на рисунке g. j: Внутриклеточный вид цитоплазматической области со скрытым доменом TM. Центральный β-лист домена FKS1 GT состоит из β3–β11, как указано. Пунктирные линии обозначают неупорядоченные области.