banner
Центр новостей
Оснащен самым современным оборудованием

пространственно-временной

Jan 12, 2024

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4906 (2022) Цитировать эту статью

8766 Доступов

5 цитат

10 Альтметрика

Подробности о метриках

Подходы к бесконтактному мечению на основе ферментов, основанные на активированных эфирах или феноксирадикалах, широко используются для картирования субклеточных протеомов и белковых интеракторов в живых клетках. Однако активированные сложные эфиры обладают низкой реакционной способностью, что приводит к широкому радиусу мечения, а фенокси-радикалы, образующиеся при обработке пероксидом, могут нарушать окислительно-восстановительные пути. Здесь мы сообщаем о методе фотоактивационно-зависимой бесконтактной маркировки (PDPL), разработанном путем генетического присоединения фотосенсибилизирующего белка miniSOG к интересующему белку. Запускаемый синим светом и регулируемый временем облучения, генерируется синглетный кислород, после чего становится возможным мечение остатков гистидина анилиновым зондом с пространственно-временным разрешением. Мы демонстрируем его высокую точность путем картирования протеомов, специфичных для органелл. Параллельное сравнение PDPL с TurboID показывает более конкретное и более глубокое протеомное покрытие PDPL. Далее мы применяем PDPL к связанному с заболеванием коактиватору транскрипции BRD4 и лигазе E3 Parkin и обнаруживаем ранее неизвестные взаимодействия. Путем скрининга сверхэкспрессии для Паркина идентифицированы два незарегистрированных субстрата Ssu72 и SNW1, процессы деградации которых опосредованы путем убиквитинирования-протеосом.

Точная характеристика белковых сетей лежит в основе многих фундаментальных клеточных процессов1. Таким образом, высокоточное пространственно-временное картирование белковых взаимодействий обеспечит молекулярную основу для расшифровки биологических путей, патологий заболеваний, а также возможности нарушения этих взаимодействий в терапевтических целях2. С этой целью крайне необходимы методы, которые могут обнаружить временные взаимодействия в живых клетках или тканях. Масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS) исторически использовалась для определения партнеров по связыванию интересующего белка (POI). Благодаря достижениям в подходах количественной протеомики была создана крупнейшая база данных белковых сетей Bioplex3.0 на основе AP-MS3. Несмотря на то, что AP-MS является чрезвычайно мощным инструментом, этапы лизиса и разведения клеток в рабочем процессе препятствуют слабым и временным взаимодействиям связывания и приводят к появлению артефактов после лизиса, таких как ложно взаимодействующие пары, не имеющие компартментализации перед лизисом4.

В попытках решить эти проблемы были разработаны неприродные аминокислоты (UAA) со сшивающими группами и платформы ферментативного мечения (PL) (например, APEX и BioID)5. Хотя методы UAA успешно применяются во многих сценариях и предоставляют информацию о прямых связывателях белков6, они по-прежнему требуют оптимизации сайтов вставки UAA. Что еще более важно, это стехиометрический метод мечения, в котором отсутствует каталитический оборот события мечения. И наоборот, ферментативные методы PL, такие как метод BioID, соединяют сконструированную биотинлигазу с POI7 с последующей активацией биотина для образования реакционноспособного промежуточного сложного эфира биотиноил-АМФ. Таким образом, фермент катализирует и высвобождает «облако» активированного биотина, которое маркирует проксимальные остатки лизина. Однако BioID требуется более 12 часов, чтобы получить достаточный сигнал мечения, что не позволяет его применять с временным разрешением. Используя направленную эволюцию на основе дрожжевого дисплея, TurboID был разработан на основе BioID с гораздо большей эффективностью, обеспечивая эффективное мечение биотина в течение 10 минут8, что позволяет изучать более динамичные процессы. Поскольку TurboID очень активен, а эндогенные уровни биотина достаточны для мечения низкого уровня, фоновое мечение становится потенциальной проблемой, когда требуется сильно усиленное и регулируемое по времени мечение за счет добавления экзогенного биотина. Более того, активированные эфиры малореактивны (t1/2 ~5 мин), что может привести к широкому радиусу мечения, особенно после насыщения соседних белков биотином5. В другом подходе генетическое слияние сконструированной пероксидазы аскорбиновой кислоты (т.е. APEX) генерирует радикалы биотина и фенола при активации H2O2 и обеспечивает мечение белка в течение минуты9,10. APEX широко используется для идентификации субклеточных протеомов, комплексов мембранных белков и комплексов цитозольных сигнальных белков11,12. Однако потребность в высоких концентрациях перекиси может повлиять на окислительно-восстановительные белки или пути, нарушая клеточные процессы.

8-fold increase in signal for probe 3, while probe 2 used in the RNA-labeling method CAP-seq only displaying ~2.5-fold signal increase, likely due to different reactivity preferences between RNA and protein (Fig. 1b, c). Furthermore, the isomers of probe 3 and hydrazine probe (probe 5, 6, 7) were also tested, confirming probe 3 as the optimized one (Supplementary Fig. 1b, c). Likewise, in-gel fluorescence analysis determined other optimized experimental parameters: illumination wavelength (460 nm), chemical probe concentration (1 mM), and illumination time (20 min) (Supplementary Fig. 2a–c). Omission of any component or step in the PDPL protocol resulted in significant reversion of signal-to-background (Fig. 1d). Notably, protein labeling was greatly reduced in the presence of sodium azide or trolox, which are known to quench singlet oxygen28. The presence of D2O, known to stabilize singlet oxygen, enhanced the labeling signal. To investigate the contribution of other reactive oxygen species to labeling, mannitol and vitamin C, established hydroxyl radical and superoxide radical scavengers respectively18,29, were added but not found to reduce labeling. The addition of H2O2 rather than illumination failed to generate labeling (Supplementary Fig. 3a). Fluorescent imaging of singlet oxygen by Si-DMA probe confirmed the presence of singlet oxygen in the HEK293T-miniSOG line, but not the parental HEK293T line. In addition, mitoSOX Red was unable to detect superoxide generation after illumination (Fig. 1e and Supplementary Fig. 3b)30. These data strongly indicate singlet oxygen as the major ROS that gives rise to subsequent proteome labeling. The cytotoxicity of PDPL, including the blue light illumination and chemical probe treatment, was evaluated, and no significant cytotoxicity was observed (Supplementary Fig. 4a)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. e Specificity analysis for proteomic data sets derived from experiments in d. Total numbers of statistically significant proteins in each organelle (red and green dots) were labeled on top. Bars show organelle-localized proteins based on MitoCarta 3.0, GO analysis, and A. Ting et. al. dataset for mitochondrial, nucleus, and ER, respectively. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>2-fold ion intensity) as well as singleton proteins that are only present in miniSOG-expressing lines (Fig. 3d red and green dots). Combining these data, we identified 1364, 461, and 911 statistically significant proteins for the nucleus, mitochondria, and ER outer membrane, respectively. To analyze the accuracy of organelle-localized PDPL, we used MitoCarta 3.0, Gene ontology (GO) analysis, and the A. Ting et al. dataset8 for mitochondria, nucleus, and ER to validate the organelle-specificity of detected proteins, which corresponded to 73.4, 78.5, and 73.0% accuracy (Fig. 3e). The specificity of PDPL validates that PDPL is an ideal tool for identifying organelle-specific proteomes. Notably, submitochondrial analysis of the identified mitochondrial proteins revealed that the captured proteome was mainly distributed in the matrix and inner membrane (226 and 106, respectively), accounting for 91.7% of the total identified mitochondrial proteins (362), which further confirmed the high-fidelity of PDPL (Supplementary Fig. 7a). Likewise, the subnuclear analysis revealed the captured proteome was predominantly distributed in the nucleus, nucleoplasm, and nucleolus (Supplementary Fig. 7b). Nucleus proteome profiling by nuclear localization signals (3xNLS) peptide revealed similar accuracy to H2B construct (Supplementary Fig. 7c–h). To define the labeling specificity of PDPL, nuclear Lamin A was selected as a more discretely localized POI bait7. PDPL identified 36 significantly enriched proteins, with 12 proteins (30.0%, including Lamin A) being well-characterized Lamin A interacting proteins annotated by the String database, representing a higher percentage than the BioID method (28 out of 122 proteins, 22.9%)7. Our method identified less proteins, likely due to the restricted labeling area, enabled by more reactive singlet oxygen. GO analysis reveals that the identified proteins are mainly located in the nucleoplasm (26), nuclear envelope (10), nuclear membrane (9), and nuclear pore (5). Combined, these nucleus-localized proteins account for 80% of the enriched proteins, further demonstrating the specificity of PDPL (Supplementary Fig. 8a–d)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. b Venn diagram showing overlapping proteins between N-terminal and C-terminal constructs. N-terminal tagging can aberrantly activate Parkin and lead to more identified proteins. c Venn diagram showing overlapping proteins between PDPL and AP-MS. Known interactors are listed, including four proteins out of 18 overlapped proteins, as well as 11 proteins out of 159 exclusively identified in PDPL. d Representative targets identified by LC-MS/MS were validated using Western blot. e Ssu72 and SNW1 were identified as unreported substrates of Parkin. Plasmids with these proteins labeled with FLAG were transfected into HEK293T and HEK293T-Parkin-miniSOG, followed by CCCP treatment across different time points. The degradation is more significant in the Parkin overexpressing line. f The Ssu72 and SNW1 degradation process was confirmed to be mediated by the ubiquitination-proteasome pathway by using the proteasome inhibitor MG132. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>7+ were rejected for MS/MS./p>7+ were rejected for MS/MS./p>2 (unless otherwise stated) and p value <0.05. Protein interaction analysis was performed using GO analysis as well as the String database./p>