Идентификация и биохимическая характеристика нового N

Том 12 научных докладов, Номер статьи: 16991 (2022) Цитировать эту статью

1154 доступа

1 Цитаты

3 Альтметрика

Подробности о метриках

N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) является ключевым компонентом гликанов, таких как гликопротеин и клеточная стенка. Киназа GlcNAc представляет собой фермент, который переносит фосфат на GlcNAc с образованием GlcNAc-6-фосфата, который может быть предшественником синтеза гликанов. Киназы GlcNAc были обнаружены у широкого круга организмов, включая патогенные дрожжи, человека и бактерии. Однако этот фермент никогда не был обнаружен в Saccharomyces cerevisiae, модели эукариот. В этом исследовании была идентифицирована первая киназа GlcNAc из S. cerevisiae, получившая название Ngk1. Значения Km Ngk1 для GlcNAc и глюкозы составили 0,11 мМ и 71 мМ соответственно, что позволяет предположить, что Ngk1 обладает высоким сродством к GlcNAc, в отличие от гексокиназ. Ngk1 продемонстрировал активность фосфорилирования GlcNAc с использованием различных нуклеозидтрифосфатов, а именно АТФ, ЦТФ, ГТФ, ИТФ и УТФ, в качестве доноров фосфорила. Ngk1 филогенетически далек от известных ферментов, поскольку идентичность аминокислотной последовательности с другими составляет всего около 20% или менее. Обсуждается также физиологическая роль Ngk1 у S. cerevisiae.

N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), распространенный углевод как у прокариот, так и у эукариот, является важным компонентом гликанов, таких как N-гликопротеины, GPI-якоря и клеточных стенок, включая пептидогликаны бактерий и хитины дрожжей1,2,3. Для биосинтеза гликанов уридиндифосфат N-ацетилглюкозамин (UDP-GlcNAc) является важным субстратом как у прокариот, так и у эукариот, поскольку фрагмент GlcNAc этого нуклеотидного сахара включается в гликаны гликозилтрансферазами2,3. Обычно UDP-GlcNAc синтезируется из фруктозо-6-фосфата (Fru-6-P), промежуточного продукта гликолиза, который может превращаться в глюкозамин-6-P3. У эукариот глюкозамин-6-P ацетилируется до GlcNAc-6-P с последующей изомеризацией до GlcNAc-1-P3. С другой стороны, у прокариот глюкозамин-6-P сначала изомеризуется в глюкозамин-1-P, а затем ацетилируется с образованием GlcNAc-1-P3,4. На заключительном этапе GlcNAc-1-P превращается в UDP-GlcNAc путем уридилирования как у прокариот, так и у эукариот3,4.

Киназа GlcNAc (EC 2.7.1.59) представляет собой фермент, метаболизирующий GlcNAc, обнаруженный у многих видов организмов, включая бактерии, патогенные дрожжи, растения и животные3,4,5,6,7,8. Этот фермент переносит гамма-фосфорильную группу АТФ на гидроксильную группу в положении C-6 GlcNAc, образуя GlcNAc-6-P. Киназа GlcNAc структурно связана с гексокиназой (EC 2.7.1.1), которая является другим типом сахарной киназы, которая действует преимущественно на глюкозу (Glc) с образованием Glc-6-P на первом этапе гликолиза, поскольку эти ферменты обычно имеют АТФазу. домен9,10. У млекопитающих киназа GlcNAc известна как фермент, обеспечивающий путь спасения биосинтеза UDP-GlcNAc, поскольку этот фермент продуцирует GlcNAc-6-P, который может быть предшественником UDP-GlcNAc11. Напротив, роль NagK, киназы GlcNAc Escherichia coli, в использовании GlcNAc для биосинтеза Fru-6-P была изучена, поскольку существует обратный путь превращения GlcNAc-6-P в Fru-6-P для источник энергии при гликолизе4. Точно так же была идентифицирована CaNag5, киназа GlcNAc патогенных дрожжей Candida albicans, и сообщалось, что она участвует в использовании GlcNAc для генерации Fru-6-P в качестве источника энергии3,5,6. Как и бактерии, C. albicans может расти на GlcNAc в качестве источника углерода. Действительно, существует путь превращения GlcNAc в Fru-6-P у C. albicans, поскольку кластер генов ферментов, метаболизирующих GlcNAc, состоит из киназы GlcNAc (CaNAG5), а также деацетилазы GlcNAc-6-P (CaNAG2) и глюкозамин-6-P деаминаза (CaNAG1) была идентифицирована по сходству последовательностей с этими ферментами E. coli4. Было показано, что нарушение этих генов замедляет рост C. albicans на GlcNAc в качестве источника углерода.

В отличие от C. albicans, почкующиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae не растут на GlcNAc в качестве источника углерода3,5,6. Более того, любой ген, сходный с CaNAG5, CaNAG2 или CaNAG1, не консервативен во всем геноме S. cerevisiae6. Поэтому считалось, что S. cerevisiae не обладает этими ферментами, метаболизирующими GlcNAc. У S. cerevisiae наличие трех гексокиназ: Hxk1, Hxk2 и Glk1 известно с 1980-х годов12. В течение нескольких десятилетий считалось, что S. cerevisiae не обладает другой гексокиназой, кроме Hxk1, Hxk2 и Glk1. Однако мы заметили и сосредоточили внимание на наличии двух других гексокиназоподобных генов (но функции которых были неизвестны): EMI2 и YLR446W. В нашей предыдущей работе белок Emi2 был идентифицирован как четвертая новая гексокиназа S. cerevisiae в дополнение к ранее известным: Hxk1, Hxk2 и Glk113. В этом исследовании мы сосредоточились на другом гексокиназоподобном гене, YLR446W (систематическое название), который не имеет стандартного названия гена, чтобы проверить, является ли он дополнительной новой гексокиназой в этом модельном организме. Неожиданно мы обнаружили, что YLR446W кодирует новую киназу GlcNAc, которая демонстрирует низкое сходство последовательностей с известными киназами GlcNAc из других организмов.